HPLC / GC AUC — SQalytics

1 Introduksi

1.1 Latar Belakang

Kromatografi — baik HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) maupun GC (Gas Chromatography) — adalah teknik kuantitatif paling penting di laboratorium kimia analitik modern. Berbeda dengan spektrofotometri yang mengukur respons total, kromatografi memisahkan campuran menjadi komponen-komponen individu sebelum diukur, sehingga memungkinkan kuantifikasi analit target di tengah matriks yang kompleks. Sinyal output adalah kromatogram — plot intensitas detektor vs waktu retensi, dengan setiap analit menghasilkan puncak (peak) pada waktu retensi karakteristiknya.

Kuantifikasi pada kromatografi mengandalkan Area Under the Curve (AUC) dari puncak target — integrasi numerik intensitas detektor di sekitar puncak. AUC berbanding linier dengan jumlah analit yang melewati detektor (hukum Beer-Lambert untuk detektor optik; hukum proporsionalitas detektor untuk MS/FID), sehingga kalibrasi standar dengan konsentrasi yang diketahui memungkinkan kuantifikasi sampel unknown. Akurasi AUC tergantung pada empat hal: peak detection yang tepat (di mana puncak mulai dan berakhir), baseline correction yang reliabel, integrasi numerik yang stabil (biasanya trapezoidal rule), dan peak matching yang konsisten antara standar dan unknown (Snyder, Kirkland, & Dolan, 2010).

1.2 Tujuan Modul

Modul HPLC / GC AUC di SQalytics ditujukan untuk:

Memproses kromatogram dengan multiple traces (standar + unknown) dalam satu tabel berbasis waktu retensi.
Mendeteksi puncak target secara otomatis (puncak terkuat bersama) atau manual (waktu retensi yang ditetapkan).
Menghitung AUC dengan trapezoidal integration dan baseline correction linier.
Membangun kurva kalibrasi AUC vs konsentrasi standar.
Menginterpolasi konsentrasi unknown dari kurva kalibrasi AUC.
Audiens utama: mahasiswa S1/S2 yang menjalankan praktikum HPLC/GC, peneliti yang menganalisis chromatogram dari bench-top instruments, laboran QC industri yang melakukan kuantifikasi rutin via kromatografi.

1.3 Posisi di Antara Alternatif

Pilih HPLC / GC AUC ketika Anda punya data kromatogram digital dalam format tabular (time vs intensity) dan ingin kuantifikasi langsung dengan kalibrasi AUC. Untuk kuantifikasi sederhana tanpa kromatografi, pakai Standard Curve + Concentration Calculation. Untuk peak deconvolution kompleks (overlapping peaks, fronting/tailing parah), pakai Trace Peak Studio (Expert Desk). Untuk identifikasi puncak melalui spektrum sesuai FTIR/UV-Vis, pakai FTIR Peak Identification atau UV-Vis Spectra.

2 Metode

2.1 Dasar Teoretis

Peak detection pada kromatogram melibatkan tiga sub-task:

Smoothing — mengurangi noise high-frequency dengan Savitzky-Golay filter (Savitzky & Golay, 1964) atau moving average.
Peak picking — mengidentifikasi puncak lokal di atas threshold tinggi minimum dan dengan width minimum.
Baseline determination — menentukan baseline lokal di kiri dan kanan puncak (biasanya rata-rata 3–5 titik di luar peak boundary).

Peak matching antara standar dan unknown — sangat krusial. Modul memakai retention time tolerance $\Delta t_R$ (default 0.1 menit untuk HPLC, 0.05 menit untuk GC isothermal). Puncak unknown dianggap berasal dari analit yang sama bila:

$$ |t_R^{\mathrm{unknown}} - t_R^{\mathrm{standard}}| < \Delta t_R $$

Integrasi AUC menggunakan trapezoidal rule untuk titik diskrit dengan koreksi baseline linier.

Faktor sistem (system suitability) — modul juga melaporkan:

Tailing factor $T_f = \dfrac{W_{0.05} \text{ at right}}{W_{0.05} \text{ at left of peak max}}$ → target USP $T_f \leq 2.0$.
Theoretical plates $N = 5.54 (t_R/W_{0.5})^2$ → target $N \geq 2000$ untuk HPLC.
Resolution $R_s = 2(t_{R,2} - t_{R,1})/(W_1 + W_2)$ → target $R_s \geq 1.5$ untuk baseline-separated antar puncak adjacent.

2.2 Persamaan Inti

Trapezoidal integration AUC:

$$ \text{AUC} = \sum_{i=1}^{N-1} \frac{(y_i + y_{i+1})}{2} \cdot (t_{i+1} - t_i) $$

Baseline-corrected intensity:

$$ y_i^{\text{corr}} = y_i - \left[\frac{y_R - y_L}{t_R - t_L}\cdot(t_i - t_L) + y_L\right] $$

dengan $(t_L, y_L)$ titik baseline kiri dan $(t_R, y_R)$ titik baseline kanan dari puncak.

Plate number (Snyder et al., 2010, Eq. 2.10):

$$ N = 5.54 \left(\frac{t_R}{W_{0.5}}\right)^2 $$

di mana $W_{0.5}$ = full width at half maximum (FWHM).

Resolution antara dua puncak adjacent:

$$ R_s = \frac{2(t_{R,2} - t_{R,1})}{W_1 + W_2} $$

dengan $W_1, W_2$ = baseline width puncak 1 dan 2.

Kuantifikasi unknown dari kurva kalibrasi AUC:

$$ \hat{C}_{\text{unknown}} = \frac{\text{AUC}_{\text{unknown}} - \text{AUC}_0}{k_{\text{cal}}} $$

2.3 Asumsi & Batas Validitas

Asumsi	Konsekuensi jika dilanggar	Cara cek di SQalytics
Puncak baseline-separated ($R_s > 1.5$)	AUC tercampur antar puncak	Modul melaporkan $R_s$; gunakan `Trace Peak Studio`
Tailing factor < 2 (USP)	Peak boundary tidak presisi	Modul melaporkan $T_f$; cek kondisi kolom HPLC
Detector response linier vs konsentrasi	Kuantifikasi non-linier	Modul cek $R^2$ kalibrasi
Baseline stabil (drift minimal)	Baseline correction bias	Inspeksi visual kromatogram
Retention time reprodusibel antar injeksi	Peak matching gagal	Toleransi $\Delta t_R$ dapat disesuaikan
Stabilitas analit di sampel/standar	Kuantifikasi salah	Kesalahan pengguna

3 Cara Kerja

3.1 Step-by-Step di SQalytics

Buka HPLC / GC AUC dari domain Kimia di sidebar.
Pada langkah Check the current trace, pastikan tabel aktif sudah dimuat sebagai trace kromatogram (1 kolom waktu + N kolom intensity).
Pada langkah Map the chromatogram columns, pilih:
- Retention time column — kolom waktu (mis. time_min).
- Standard trace columns — beberapa kolom kromatogram standar.
- Unknown trace columns — beberapa kolom kromatogram unknown.
Isi Standard concentrations dengan list konsentrasi yang urutannya sesuai kolom standar (mis. [10, 25, 50]).
Pada langkah Choose the target peak, pilih mode:
- Auto target peak detection — modul memilih puncak terkuat yang konsisten antar trace standar.
- Use known retention time — manual, masukkan $t_R$ target.
Atur Peak matching tolerance $\Delta t_R$ (default 0.1 min).
Klik Quantify Peak Area.
Tinjau hasil: kesimpulan ringkas → tabel Target peak summary → tabel Calibration → tabel Unknown results → grafik kromatogram + kalibrasi.

Jika hasil kromatogram dan kurva kalibrasi sudah siap dipoles untuk laporan atau manuskrip, lanjutkan ke Step 5 opsional untuk mengirim Chromatogram overlay atau AUC calibration ke Publication Graph Studio (PGS). Di sana Anda bisa melanjutkan tipografi, legenda, pratinjau cetak, dan ekspor SVG / PNG / PDF.

3.2 Template Tabel Input + Contoh Data Sintetis

Skema tabel input:

Kolom	Tipe	Satuan	Wajib	Catatan
`time_min`	numeric	menit	✓	Sumbu waktu retensi
`STD_<C>ppm`	numeric	a.u. / mAU	✓	Min 3 trace standar
`UNK_<id>`	numeric	a.u. / mAU	✓	Min 1 trace unknown

Contoh data sintetis (14 baris × 6 kolom — kromatogram dengan peak target di Rt ≈ 4.5 min):

time_min	STD_10ppm	STD_25ppm	STD_50ppm	UNK_S1	UNK_S2
0.0	12	15	18	14	16
1.0	15	18	22	17	19
2.0	18	20	25	19	21
3.0	22	26	32	24	28
4.0	85	182	348	122	195
4.3	210	490	958	312	532
4.5	295	710	1392	442	764
4.7	198	460	890	295	494
5.0	78	175	338	115	188
6.0	21	25	31	23	26
7.0	17	20	25	19	22
8.0	14	17	21	16	18
9.0	12	15	19	14	17
10.0	11	14	17	13	15

SYNTHETIC Kromatogram HPLC-UV dengan puncak target Gaussian centered di Rt = 4.5 min (FWHM ≈ 0.4 min). Tiga konsentrasi standar (10, 25, 50 ppm) menghasilkan AUC yang berbanding linier; dua unknown (S1, S2) diharapkan menghasilkan konsentrasi ~15 dan ~28 ppm. Baseline noise ≈ 15 a.u. CSV setara tersedia di docs/assets/example-data/id/chemistry/template_chromatogram.csv.

3.3 Contoh Luaran

Tabel Target peak summary:

Trace	$t_R$ (min)	Peak height (a.u.)	AUC (a.u.·min)	Plate $N$	Tailing $T_f$
STD_10ppm	4.50	295	213.4	4520	0.98
STD_25ppm	4.50	710	512.8	4495	0.99
STD_50ppm	4.50	1392	1008.5	4510	0.98
UNK_S1	4.50	442	318.7	4480	1.01
UNK_S2	4.50	764	552.9	4500	0.99

Tabel Calibration:

Parameter	Nilai
Model	Linier
Slope ($k_{\text{cal}}$)	19.88 a.u.·min/ppm
Intercept ($\text{AUC}_0$)	14.47 a.u.·min
$R^2$	0.99997
Working range	~5 – 100 ppm

Tabel Unknown results:

Sample	AUC	$\hat{C}$ (ppm)	95% PI	RSD
UNK_S1	318.7	15.30	[15.0, 15.6]	0.9%
UNK_S2	552.9	27.10	[26.8, 27.4]	0.7%

Kesimpulan ringkas: "Puncak target terdeteksi otomatis pada $t_R$ = 4.50 ± 0.02 min (konsisten antar 5 trace). Plate number $N$ ≈ 4500 (memenuhi USP $N \geq 2000$), tailing $T_f \approx 1.0$ (peak simetris, di bawah USP $T_f \leq 2.0$). Kurva kalibrasi AUC vs konsentrasi sangat linier ($R^2$ = 0.99997). Kuantifikasi: UNK_S1 = 15.3 ppm, UNK_S2 = 27.1 ppm, semua di working range. RSD < 1%, presisi excellent."

Grafik utama: kromatogram overlay 5 trace (warna berbeda) dengan area puncak target di-shade dan label AUC + $t_R$. Insert kecil di pojok: kurva kalibrasi AUC vs konsentrasi dengan unknown teranotasi.

Kromatogram overlay 5 trace dengan peak target shaded dan insert kalibrasi AUC — Gambar 1. Analisis kromatogram HPLC-UV dua-panel: **(a)** Overlay 5 *trace* (3 standar dengan konsentrasi 10, 25, 50 ppm + 2 sampel *unknown* S1 dan S2) menunjukkan puncak target tunggal terkonsentrasi di *t_R* = 4.50 min (Gaussian, FWHM ≈ 0.4 min). Area di bawah puncak (arsir merah muda) merepresentasikan AUC yang diintegrasikan dengan *trapezoidal rule* setelah koreksi *baseline* linier. *System suitability* terpenuhi: plate N ≈ 4500 (USP > 2000), *tailing factor* *T_f* ≈ 1.0 (USP ≤ 2.0). **(b)** Kurva kalibrasi AUC vs konsentrasi standar (linier, R² = 0.99997); *marker* diamond menunjukkan interpolasi *unknown* — **S1 = 15.3 ppm** dan **S2 = 27.1 ppm**, keduanya di working range.

4 Kesimpulan

4.1 Relevansi Real-World

HPLC / GC AUC adalah modul harian untuk laboratorium yang menjalankan kromatografi rutin. Aplikasi konkret:

Kuantifikasi flavonoid total via HPLC-UV — pengukuran kuersetin, luteolin, apigenin pada ekstrak tanaman.
Vitamin C pada produk pangan — HPLC-UV pada λ = 254 nm dengan kalibrasi standar ascorbic acid.
Asam organik (asam sitrat, malat, asetat) pada fermentasi — HPLC dengan kolom RP atau ion-exclusion.
Pestisida residu via GC-MS — kuantifikasi senyawa organofosfat, organoklorin, piretroid pada produk pertanian.
Asam lemak via GC-FID — analisis profil asam lemak setelah derivatisasi menjadi FAME.

Dalam konteks publikasi IMRAD, output AUC + konsentrasi unknown menjadi Tabel utama di bagian Hasil, dan kromatogram overlay (dengan peak target di-shade) menjadi Figure utama untuk visualisasi karakterisasi profil senyawa. Pada Rencana Publikasi Singkil v5, modul ini dipakai pada T3 Tahap 2 untuk profil UHPLC-HRMS senyawa flavonoid kunci pada UAE-opt vs MAE-opt — output langsung menjadi Tabel 3 manuskrip.

4.2 Where to Go from Here

Modul lanjutan di SQalytics:

Method Validation & QC — untuk evaluasi formal recovery + presisi inter-day + LOD/LOQ kromatografi.
Concentration Calculation — bila perlu workflow kuantifikasi non-kromatografi.
Internal Standard — untuk koreksi drift instrumen pada batch HPLC/GC panjang.
Trace Peak Studio (Expert Desk) — bila peak deconvolution kompleks, fronting/tailing parah, atau perlu peak picking manual yang granular.
FTIR Peak Identification — bila ingin identifikasi puncak via spektrum FTIR untuk validasi senyawa target.

Pembacaan lanjutan:

Snyder, Kirkland, & Dolan (2010), Bab 11 — peak integration dan system suitability.
ICH M10 (2019) — bioanalytical method validation untuk industri farmasi.
USP <621> Chromatography — standar internasional system suitability HPLC.
Skoog et al. (2014), Bab 31 — fundamental kromatografi cair.

⚙ Troubleshooting Cepat

Hasil gagal karena unknown kosong. Pastikan kolom unknown dipilih terpisah dari kolom standar di langkah Map the chromatogram columns.

Jumlah konsentrasi standar tidak cocok. Jumlah angka di Standard concentrations harus sama dengan jumlah kolom standar yang dipilih.

Tidak ada puncak yang cocok. Perlebar Peak matching tolerance (mis. 0.1 → 0.2 min) atau gunakan mode manual Use known retention time.

Tailing factor > 2. Indikasi kondisi kolom HPLC menurun; lakukan rinse/regenerasi kolom atau ganti mobile phase pH.

Plate number $N$ < 2000. Kolom HPLC sudah lewat usia atau ada void di kolom; pertimbangkan repacking atau replace.

$R^2$ kalibrasi < 0.99. Cek apakah ada outlier trace standar, atau working range terlalu lebar — coba split menjadi low/high range kalibrasi terpisah.

i Riwayat Revisi

Riwayat Revisi Panduan

Tanggal	Revisi	Penulis
2026-05-12	Migrasi MD v2 → HTML final dengan figure kromatogram + AUC shaded + insert kalibrasi	Claude
2026-05-12	Migrasi v1 → v2 (template publikasi + KaTeX trapezoidal AUC + system suitability USP + APA)	Claude
2026-05-09	Draft awal v1	Tim docs

4 Referensi

Savitzky, A., & Golay, M. J. E. (1964). Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry, 36(8), 1627–1639. https://doi.org/10.1021/ac60214a047
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2010). Introduction to modern liquid chromatography (3rd ed.). John Wiley & Sons.
Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2014). Fundamentals of analytical chemistry (9th ed.). Cengage Learning — Bab 31–32 untuk HPLC + GC.
United States Pharmacopeia. (2024). USP <621> Chromatography: System suitability requirements. USP-NF.
International Council for Harmonisation. (2019). ICH M10: Bioanalytical method validation. ICH Harmonised Guideline.